Nella fecondazione assistita, la crioconservazione è uno dei fattori cruciali per la buona riuscita del trattamento.

La crioconservazione di gameti, embrioni e tessuti di natura gonadica ha progressivamente acquisito un ruolo sempre più ampio e importante nella procreazione medicalmente assistita (PMA).

Si tratta di un processo che permette di aumentare le probabilità cumulative di successo di una procedura di PMA consentendo di ottimizzare l’utilizzo di embrioni e limitando i rischi di complicanze legate alla procedura. Permette inoltre la preservazione della fertilità nei pazienti che desiderano posticipare la genitorialità per motivi sociali ma anche e soprattutto per motivi di natura medica.

La criobiologia è la branca della biologia che analizza il funzionamento degli organismi viventi, degli organi, dei tessuti e delle cellule a basse temperature.

La crioconservazione è una branca della criobiologia che consente il mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di -196° C in azoto liquido.

Il principio fondamentale della crioconservazione è quello di interrompere i processi biochimici del metabolismo cellulare.

Questo si ottiene trasformando in ghiaccio (congelamento) a temperature basse, l’acqua presente all’interno delle cellule.

Oltre al congelamento risulta importante anche la fase di scongelamento. Infatti, la crioconservazione è valida se il sistema biologico torna a temperatura normale senza dover sopportare insulti strutturali o biochimici che possono portare alla morte cellulare.

Grazie alle tecniche di crioconservazione è possibile crioconservare: Spermatozoi, Tessuto testicolare, Ovociti, Tessuto ovarico ed Embrioni.

Le tecniche di crioconservazione sono lo Slow-Freezing cioè il congelamento lento e la vitrificazione ovvero il congelamento rapido.

Il congelamento lento tende a prevenire la formazione di ghiaccio intracellulare, principale fonte di danno cellulare durante il processo di crioconservazione, attraverso una lenta deidratazione verificantesi durante un lento e controllato abbassamento della temperatura. In tal modo, la cristallizzazione dell’acqua avviene nell’ambiente extracellulare, ma non si estende (o non dovrebbe estendersi) al compartimento extracellulare.

La vitrificazione persegue invece l’obiettivo di impedire la formazione di ghiaccio intracellulare attraverso un quasi istantaneo abbassamento della temperatura, facendo in modo che il tempo richiesto per la transizione termica non sia sufficiente affinché le molecole di acqua possano organizzarsi in un reticolo cristallino.

La vitrificazione è un procedimento di crioconservazione attraverso il quale si elimina il congelamento di una soluzione, con conseguente eliminazione degli effetti avversi della formazione dei cristalli di ghiaccio.

Consiste in un processo di solidificazione nel quale si verifica un repentino incremento della viscosità del medium che produce una condizione simile al vetro.

L’esposizione alla soluzione di vitrificazione deve essere molto breve per evitare effetti dannosi dovuti alla tossicità dei crioprotettori.

Il warming deve essere altrettanto rapido per evitare formazione di cristalli all’aumentare della temperatura.

Per crioconservare con successo cellule, tessuti e organi è essenziale applicare una forma di crioprotezione che impedisca la formazione di ghiaccio intracellulare e il manifestarsi di altri fenomeni indesiderati derivanti direttamente o indirettamente dalla formazione di ghiaccio.

La citoprotezione può essere ottenuta attraverso l’uso di agenti crioprotettori (ACP). Queste sono sostanze di diversa natura chimica, caratterizzate da elevata solubilità in acqua che stabilizzano la struttura delle membrane con azione sulle componenti lipoproteiche. I crioprotettori possono essere permeanti o non permeanti in base alla capacità di penetrare, attraverso la membrana plasmatica, all’interno delle cellule.

I crioprotettori permenati sono: dimetilsulfossido (DMSO), Metanolo, glicole etilenico (EG), glicole propilenico (GP) e glicerolo.

Invece i crioprotettori non permenati sono: saccarosio, polivinilpirrolidone (PVP) e trealosio.

I crioprotettori hanno la funzione di: prevenire danni cellulari (citoscheletro e membrane), ridurre il punto di congelamento della soluzione e di far avvenire la disidratazione prima della formazione dei cristalli di ghiaccio.

Rispetto al congelamento lento, la vitrificazione permette la solidificazione delle cellule e dell’ambiente intracellulare in uno stato simile al vetro senza la formazione di ghiaccio.

Il metodo prevede un uso di alte concentrazioni iniziali di crioprotettore (riducendo drasticamente i tempi di esposizione per evitarne la citotossicità), bassi volumi di terreno di congelamento e velocità di raffreddamento ultra-rapido.

 Negli ultimi 15 anni sono stati descritti molti protocolli di vitrificazione che differiscono per: crioprotettori, volumi dei terreni di congelamento, supporti di congelamento, metodi di congelamento e scongelamento. 

Ad oggi il protocollo più utilizzato per la vitrificazione di ovociti ed embrioni è il protocollo «Cryotop Kitazato» che comporta la combinazione di 15% DMSO, 15% EG, 0,5 M saccarosio in un volume minimo. Il metodo di vitrificazione Cryotop/Kitazato si è dimostrato uno strumento molto utile per la crioconservazione degli ovociti, dando ottimi risultati in termini di sopravvivenza e outcome clinico.